Mutações sítio-dirigidas na metacaspase de S. cerevisiae: Uma abordagem, metodológica avançada para estudos estruturais e funcionais

Resumen

Objetivo: As metacaspases são cisteína-proteases que requerem cálcio para atividade e se ativam por autoprocessamento, diferentemente das caspases. As metacaspases são categorizadas em tipos I, II e III, como a ScMCA-IA em Saccharomyces cerevisiae, associada à apoptose. O estudo buscou clonar um ScMCA-IA recombinante, com mutações específicas nos resíduos Cys155 e Cys276, expressando e purificando essas proteínas. Os mutantes foram obtidos com sucesso usando sobreposição de fragmentos e método TEDA de clonagem, expressos em E. coli e purificados por cromatografia de camada e exclusão molecular. A identificação da importância da cisteína Cys155 no autoprocessamento da ScMCA-IA e a sugestão de um segundo processamento intermolecular entre metacaspases ativas, semelhante à ativação das caspases, foram resultados notáveis. Mostrou-se que os processamentos levam à forma ativa da enzima no C-terminal, diferente do descrito anteriormente. Concluindo, a presença de uma segunda cisteína catalítica na ScMCA-IA foi evidenciada, trazendo uma nova perspectiva sobre sua ativação, com processamentos antes não descritos, tanto autoprocessamento quanto intermolecular.